คณะอัศวินฮอสปิทัลเลอร์ (อังกฤษ: Knights Hospitaller) หรือคณะฮอสปิทัลเลอร์ (Order of Hospitallers) เป็นคณะบุรุษที่ทำงานที่โรงพยาบาลอมาลฟิที่ตั้งขึ้นในเยรูซาเลมในปี ค.ศ. 1080 เพื่อเป็นสถานที่สำหรับคนยากจน ผู้แสวงบุญ และผู้ที่ได้รับบาดเจ็บที่เดินทางมายังดินแดนศักดิ์สิทธิ์ หลังจากคริสตจักรตะวันตกได้รับชัยชนะต่อเยรูซาเลมในปี ค.ศ. 1099 ระหว่างสงครามครูเสดครั้งที่ 1 โรงพยาบาลอมาลฟิก็ก่อตั้งเป็นคณะทหารภายใต้กฎบัตร (charter) โดยมีหน้าที่ในการดูแลผู้บาดเจ็บและป้องกันดินแดนศักดิ์สิทธิ์ หลังจากที่เยรูซาเลมเสียเมืองแก่ฝ่ายมุสลิมคณะอัศวินฮอสปิทัลเลอร์ก็ย้ายไปตั้งถิ่นฐานใหม่ที่โรดส์เป็นอาณาจักรของตนเอง และต่อมาที่มอลตาเป็นประเทศราชภายใต้การปกครองของอุปราชสเปนประจำซิซิลี
ในปี ค.ศ. 600 อธิการโพรบัส (Abbot Probus) ได้รับมอบหมายจากสมเด็จพระสันตะปาปาเกรกอรีที่ 1 ให้สร้างสถานพยาบาลในกรุงเยรูซาเลมเพื่อดูแลนักแสวงบุญชาวคริสต์ที่เดินทางไปยังดินแดนศักดิ์สิทธิ์ ในปี ค.ศ. 800 ชาร์เลอมาญจักรพรรดิแห่งจักรวรรดิโรมันอันศักดิ์สิทธิ์ขยายสถานพยาบาลของโพรบัสและเพิ่มห้องสมุด ราวสองร้อยปีต่อมาในปี ค.ศ. 1005, กาหลิบอัล-ฮาคิม บิ-อมร อัลลอฮ์ (Al-Hakim bi-Amr Allah) ทำลายสถานพยาบาลและบ้านเรือนอื่น ๆ อีกสามพันหลังในกรุงเยรูซาเลม ในปี ค.ศ. 1023 พ่อค้าจากอามาลฟิ และซาเลอร์โน ในอิตาลีได้รับอนุญาตให้สร้างสถานพยาบาลใหม่โดยกาหลิบอาลิ อัซ-ซาเฮียร์ (Ali az-Zahir) แห่งอียิปต์ สถานพยาบาลใหม่สร้างบนที่ที่เดิมเป็นอารามของนักบุญยอห์นผู้ให้รับบัพติศมาบริหารโดยนักพรตคณะเบเนดิกติน
คณะฮอสปิทัลเลอร์อารามิกได้รับก่อตั้งขึ้นเป็นคณะนักบวชหลังสงครามครูเสดครั้งที่ 1 โดยบุญราศีเจอราร์ด โทม (Gerard Thom) ที่ได้รับการอนุมัติโดยพระบัญญัติพระสันตะปาปา (Papal bull) ของสมเด็จพระสันตะปาปาปาสคาลที่ 2 ในปี ค.ศ. 1113 เจอราร์ดขยายดินแดนของคณะและรายได้ไปทั่วราชอาณาจักรเยรูซาเลมและอาณาบริเวณที่ไกลออกไปจากนั้น นอกไปเรมงด์ดูปุยแห่งโปรวองซ์ (Raymond du Puy de Provence) ผู้นำคนต่อมาก่อตั้งสถานพยาบาลที่สำคัญไม่ไกลจากโบสถ์โฮลีเซพัลเครอ (Church of the Holy Sepulchre) ในเยรูซาเลมโดยมีจุดประสงค์เมื่อเริ่มแรกในการดูแลรักษานักแสวงบุญในเยรูซาเลม แต่ต่อมาก็รวมไปถึงการให้บริการคุ้มครองนักแสวงบุญโดยผู้ถืออาวุธและขยายตัวจนกลายเป็นกองกำลังที่มีขนาดใหญ่พอสมควร
ผู้พยาบาลหรือฮอสปิทัลเลอร์ (The Hospitallers) และอัศวินเทมพลาร์ (Knights Templar) ที่ก่อตั้งในปี ค.ศ. 1119, กลายเป็นกลุ่มคริสต์ศาสนิกชนสำคัญผู้มีอำนาจอยู่ในบริเวณนั้น คณะมาได้รับชื่อเสียงหลังจากการต่อสู้กับฝ่ายมุสลิมหลายครั้ง ทหารของฮอสปิทัลเลอร์สวมเสื้อคลุมสีดำที่มีกางเขนขาว
เมื่อมาถึงกลางคริสต์ศตวรรษที่ 12 ลัทธิอัศวินฮอสปิทัลเลอร์ก็แบ่งเป็นกองทหารและกลุ่มผู้ทำงานกับผู้เจ็บป่วยแต่ก็ยังเป็นคณะนักบวชและได้รับสิทธิพิเศษต่าง ๆ จากพระสันตะปาปา เช่นไม่ต้องอยู่ในอำนาจการปกครองของผู้ใดนอกไปจากอำนาจการปกครองของพระสันตะปาปา ไม่ต้องเสียภาษีและมีสิทธิในการเป็นเจ้าของสิ่งก่อสร้างทางศาสนาด้วยตนเองได้ คณะอัศวินเท็มพลาร์และฮอสปิทัลเลอร์สร้างป้อมปราการต่าง ๆ ในดินแดนอันศักดิ์สิทธิ์ ในช่วงเวลาที่รุ่งเรืองที่สุดของราชอาณาจักรเยรูซาเลมฮอสปิทัลเลอร์มีป้อมใหญ่ ๆ เจ็ดป้อมและอสังหาริมทรัพย์อีก 140 แห่ง สองแห่งที่ใหญ่ที่สุดในราชอาณาจักรและในราชรัฐแอนติออก (Principality of Antioch) คือปราสาทเชวาลีเยร์ (Krak des Chevaliers) และปราสาทมาร์กัท (Margat) ทรัพย์สินของคณะแบ่งเป็นไพรออรี (Priory) ที่แบ่งออกเป็นเบลลิวิค (bailiwick) เฟรดเดอริค บาร์บารอซซาจักรพรรดิแห่งจักรวรรดิโรมันอันศักดิ์สิทธิ์ทรงสัญญาว่าจะพิทักษ์อัศวินแห่งเซนต์จอห์นในเอกสารพระราชนุญาตของปี ค.ศ. 1185
การขยายอำนาจของอิสลามในบริเวณตะวันออกกลางจนในที่สุดก็สามารถขับอัศวินออกจากเยรูซาเลม หลังจากราชอาณาจักรเยรูซาเลมล่มในปี ค.ศ. 1291 (กรุงเยรูซาเลมเองล่มในปี ค.ศ. 1187) อัศวินก็ถูกจำกัดบริเวณอยู่แต่ในอาณาจักรเคานท์แห่งตริโปลี และเมื่อเอเคอร์ถูกยึดในปี ค.ศ. 1291 อัศวินก็ต้องไปหาที่ตั้งใหม่ในราชอาณาจักรไซปรัส หลังจากการเข้าไปพัวพันกับการเมืองในไซปรัส แกรนด์มาสเตอร์ กีโยม เดอ วิลลาเรต์ (Guillaume de Villaret) ก็วางแผนที่จะหาที่ดินที่เป็นของคณะเองโดยเลือกเกาะโรดส์เป็นที่ตั้งใหม่ ผู้นำคนต่อมา ฟุล์คส์ เดอ วิลลาเรต์ (Fulkes de Villaret) ทำตามแผนที่วางไว้และเมื่อวันที่ 15 สิงหาคมค.ศ. 1309 หลังจากต่อสู้กันอยู่สองปี เกาะโรดส์ก็ยอมแพ้ นอกจากโรดส์แล้ว อัศวินก็ยังยึดเกาะบริเวณใกล้เคียงกันอีกหลายเกาะ และเมืองท่าอานาโตเลียสองเมืองคือ โบดรัม (Bodrum) และคาสเตโลริโซ (Kastelorizo)
อัศวินเทมพลาร์ถูกยุบเลิกในปี ค.ศ. 1312 และทรัพย์สินและที่ดินส่วนใหญ่ถูกยกให้กับฮอสปิทัลเลอร์ (Hospitaller) ทรัพย์สินและที่ดินแบ่งออกเป็น 8 บริเวณทังก์ (Tongue) (อารากอน, โอแวร์ญ, คาสตีล, อังกฤษ, ฝรั่งเศส, เยอรมนี, อิตาลี และโปรวองซ์) แต่ละบริเวณก็ปกครองก็บริหารโดยไพรเออร์ (Prior) หรือถ้ามีมากกว่าหนึ่งไพรเออรีในบริเวณนั้นก็จะปกครองโดยแกรนด์ไพรเออร์ ที่โรดส์และมอลตาอัศวินที่ประจำอยู่ที่ทังก์แต่ละทังก์ก็นำโดย “Bailli” แกรนด์ไพรเออร์ของอังกฤษในขณะนั้นคือฟิลลิป เทม (Philip Thame) ผู้เป็นผู้หาที่ดินที่ตั้งของบริเวณทังก์ในอังกฤษระหว่างปี ค.ศ. 1330 ถึงปี ค.ศ. 1358
เมื่อตั้งถิ่นฐานอยู่บนเกาะโรดส์ อัศวินเซนต์จอห์นที่รู้จักกันในชื่อ “อัศวินแห่งโรดส์” ด้วย ก็จำยอมต้องกลายเป็นนักรบเพิ่มขึ้นอีกโดยเฉพาะในการต่อสู้กับโจรสลัดบาร์บารี อัศวินแห่งโรดส์สามารถป้องกันการรุกรานในคริสต์ศตวรรษที่ 15 ได้สองครั้ง หนึ่งโดยสุลต่านแห่งอียิปต์ในปี ค.ศ. 1444 และอีกครั้งหนึ่งโดยสุลต่านเมห์เหม็ดที่ 2แห่งจักรวรรดิออตโตมันในปี ค.ศ. 1480 ผู้ที่หลังจากยึดยึดคอนสแตนติโนเปิลได้ในปี ค.ศ. 1453 แล้วก็ทรงหันมาตั้งเป้าที่จะทำลายอัศวินแห่งโรดส์
ในปี ค.ศ. 1494 อัศวินแห่งโรดส์ก็ไปตั้งที่มั่นที่แหลมฮาลิคาร์นัสซัส (ปัจจุบันโบดรัม) อัศวินใช้ส่วนที่ไม่ถูกทำลายของซากที่บรรจุศพแห่งมอสโซลอส (Mausoleum of Maussollos) (หนึ่งในเจ็ดสิ่งมหัศจรรย์ของโลกยุคโบราณ) ไปใช้ในการสร้างเสริมปราสาทโบดรัม
ในปี ค.ศ. 1522 สุลต่านสุลัยมานแห่งจักรวรรดิออตโตมันก็ทรงนำกองทัพเรือ 400 ลำและทหารราบจำนวน 200,000 มารุกรานโรดส์ ทางฝ่ายอัศวินภายใต้การนำของแกรนด์มาสเตอร์ ฟิลลิป วิลลิเยร์ เดอ ลิสเซิล-อาดัน (Philippe Villiers de L'Isle-Adam) มีทหารด้วยกันทั้งหมด 7,000 คนและป้อม การล้อมโรดส์ใช้เวลาห้าเดือน ในที่สุดผู้ที่รอดจากการโจมตีก็ได้รับพระบรมราชานุญาตจากสุลต่านสุลัยมานให้ออกจากโรดส์ อัศวินแห่งโรดส์จึงถอยไปตั้งหลักที่ซิซิลี
หลังจากที่เร่ร่อนจากที่หนึ่งไปอีกที่หนึ่งอยู่ 7 ปีในยุโรป อัศวินก็ก่อตั้งใหม่ในปี ค.ศ. 1530 เมื่อสมเด็จพระเจ้าชาร์ลส์ที่ 5 แห่งสเปนในฐานะพระมหากษัตริย์แห่งซิซิลีก็พระราชทานมอลตาให้แก่คณะ พร้อมทั้งโกโซ (Gozo) และทริโปลี (Tripoli) เมืองท่างของแอฟริกาเหนือในการเป็นอาณาจักรเป็นการแลกเปลี่ยนกับเหยี่ยวมอลตาหนึ่งตัวต่อปีที่ต้องนำมามอบให้แก่อุปราชแห่งซิซิลี ผู้เป็นผู้แทนพระองค์ในวัน “All Souls Day” ของทุกปี (ข้อมูลนี้นำไปใช้เป็นโครงเรื่องของนวนิยายที่มีชื่อเสียงเรื่อง “The Maltese Falcon” โดยดาชิลล์ แฮมเม็ทท์)
อัศวินฮอสปิทัลเลอร์ก็ยังคงต่อสู้กับฝ่ายมุสลิมอยู่ และโดยเฉพาะกับกลุ่มโจรสลัดบาร์บารี แม้ว่าจะมีกองเรือเพียงไม่กี่ลำแต่ก็ทำให้เป็นที่เคืองพระทัยของสุลต่านออตโตมัน ที่เห็นว่าอัศวินฮอสพิทาลเลอร์สามารถไปหาที่มั่นใหม่ได้ ในปี ค.ศ. 1565 สุลต่านสุลัยมานจึงทรงส่งกองทัพจำนวน 40,000 คนมาล้อมอัศวิน 700 คนและทหารอีก 8,000 คนเพื่อจะกำจัดอัศวินออกจากมอลตา
ในช่วงแรกของการรุกราน สถานะการณ์ดูเหมือนจะซ้ำรอยกับที่โรดส์ที่ฝ่ายฮอสปิทัลเลอร์เพลี่ยงพล้ำ เมืองต่าง ๆ เกือบทุกเมืองถูกทำลายและอัศวินครึ่งหนึ่งถูกสังหาร เมื่อวันที่ 18 สิงหาคม สถานะการณ์ของฝ่ายอัศวินก็ถึงจุดวิกฤติ ทหารถูกฆ่าตายไปเป็นจำนวนมากและอ่อนกำลังลงทุกวัน แต่เมื่อสภาสงครามเสนอให้ทิ้งอิลบอร์โก (Il Borgo) และเซ็งเกลีย (Senglea) และถอยไปยังป้อมเซนต์แอนเจโล (Fort St. Angelo) แกรนด์มาสเตอร์ ฌอง ปาริโซต์ เดอ ลา วาเลตต์ (Jean Parisot de la Valette) ปฏิเสธ
อุปราชแห่งซิซิลีก็ไม่ส่งกองหนุนมาช่วยซึ่งอาจจะเป็นเพราะพระราชโองการจากพระเจ้าฟิลลิปที่ 2 แห่งสเปนคลุมเครือที่ทำให้การตัดสินใจช่วยหรือไม่ช่วยตกอยู่ในความรับผิดชอบของอุปราช ถ้าตัดสินใจผิดก็หมายถึงการพ่ายแพ้และทำให้ซิซิลีและเนเปิลส์ตกอยู่ในอันตรายจากฝ่ายออตโตมัน ตัวอุปราชเองก็ทิ้งลูกชายไว้กับวาเลตต์บนเกาะ ฉะนั้นจึงไม่ใช่การตัดสินใจที่ง่ายนัก แต่ไม่ว่าจะด้วยสาเหตุใดอุปราชก็ลังเลในการส่งกองกำลังไปช่วยจนกระทั่งผลของการถูกโจมตีแทบจะอยู่ในมือของอัศวินที่ถูกละทิ้งอยู่บนเกาะ
เมื่อวันที่ 23 สิงหาคมก็มีการโจมตีครั้งใหญ่ครั้งสุดท้ายโดยผู้ที่มาล้อม สถานะการณ์คับขันจนแม้แต่ทหารผู้บาดเจ็บก็ต้องร่วมเข้าต่อสู้ป้องกันด้วย แต่การโจมตีของฝ่ายออตโตมันก็ไม่รุนแรงนักนอกจากที่ป้อมเซนต์เอลโม ซึ่งทำให้ป้อมต่าง ๆ ยังต่อต้านอยู่ได้ ทางฝ่ายอัศวินก็ซ่อมแซมกำแพงส่วนที่ถูกตีแตกทั้งกลางวันและกลางคืน สำหรับฝ่ายออตโตมันการยึดมอลตาดูจะยากขึ้นทุกวัน กองกำลังที่พักอยู่ในที่แคบจำกัดก็ล้มป่วยและเสียชีวิตกันมากมายระหว่างช่วงฤดูร้อน อาวุธและอาหารก็เริ่มร่อยหรอลงและกำลังใจในการต่อสู้ของทางฝ่ายออตโตมันก็เริ่มลดถอยลงเพราะความพ่ายแพ้ในการพยายามโจมตีหลายครั้งที่ได้รับ นอกจากนั้นแล้วเมื่อวันที่ 23 มิถุนายนทางฝ่ายออตโตมันก็สูญเสียเทอร์กุต ไรส์ (Turgut Reis) ผู้เป็นแม่ทัพเรือผู้มีประสิทธิภาพซึ่งเป็นการสูญเสียครั้งใหญ่ แม่ทัพสองคนที่เหลืออยู่ ปิยาเล ปาชา (Piyale Pasha) และลาลา คารา มุสตาฟา ปาชา (Lala Kara Mustafa Pasha) เป็นผู้มีความเลินเล่อ ทั้งสองมีกองทัพเรือขนาดใหญ่ที่ใช้อย่างมีประสิทธิภาพเพียงครั้งเดียว, ขาดการติดต่อกับฝั่งอาฟริกา และไม่พยายามระวังการโจมตีจากแนวหลังโดยซิซิลี
เมื่อวันที่ 1 กันยายน ปิยาเลและลาลาก็พยายามเป็นครั้งสุดท้าย แต่กำลังขวัญของทหารฝ่ายออตโตมันก็อยู่ในสภาพที่ย่ำแย่ ซึ่งทำให้การโจมตีเป็นไปอย่างไม่เต็มใจเท่าใดนัก ทำให้อัศวินผู้ที่ถูกล้อมมีกำลังใจดีขึ้นและเริ่มมองเห็นทางที่จะได้รับชัยชนะ ทางฝ่ายออตโตมันมีความตกประหวั่นเมื่อได้ข่าวว่าทางซิซิลีส่งกำลังมาช่วยโดยหาทราบไม่ว่าเป็นเพียงกองกำลังเพียงกองเล็ก ๆ แต่ก็มีผลทำให้ละทิ้งการล้อมเมื่อวันที่ 8 กันยายน การล้อมมอลตาจึงเป็นชัยชนะครั้งสุดท้ายของอัศวินแห่งเซนต์จอห์น
เมื่อฝ่ายออตโตมันถอยทัพไปแล้วฮอสปิทัลเลอร์ก็เหลือกำลังคนอยู่เพียง 600 คนที่ถืออาวุธได้ การสันนิษฐานที่เชื่อถือได้กล่าวว่าฝ่ายออตโตมันตอนที่มีกำลังคนสูงสุดมีถึง 40,000 คนและเหลือ 15,000 คนกลับไปคอนสแตนติโนเปิล การล้อมเป็นภาพที่บันทึกไว้บนจิตรกรรมฝาผนังโดยมัตเตโอ เปเรซ ดาลเล็ชชิโอ (Matteo Perez d'Aleccio) ในท้องพระโรงเซนต์ไมเคิลและเซนต์จอร์จหรือที่เรียกว่าท้องพระโรงพระราชบัลลังก์ (Throne Room) ในวังของแกรนด์มาสเตอร์ในวาเล็ตตา ความเสียหายที่ได้รับจากการล้อมเมืองทำให้ต้องสร้างเมืองใหม่ - เมืองปัจจุบันวาเล็ตตาเพื่อเป็นอนุสรณ์แก่แกรนด์มาสเตอร์ผู้ต่อต้านการล้อมโดยไม่ยอมถอย
ในปี ค.ศ. 1607 แกรนด์มาสเตอร์ฮอสปิทัลเลอร์ก็ได้รับฐานะเป็น “Reichsf?rst” (เจ้าชายแห่งจักรวรรดิโรมันอันศักดิ์สิทธิ์ แม้ว่าดินแดนของฮอสปิทัลเลอร์จะอยู่ทางใต้ของจักรวรรดิโรมันอันศักดิ์สิทธิ์) ในปี ค.ศ. 1630 แกรนด์มาสเตอร์ก็ได้รับแต่งตั้งให้มีฐานะทางศาสนาเท่าเทียมกับพระคาร์ดินัลที่ใช้คำนำหน้าที่เป็นเอกลักษณ์ว่า “His Most Eminent Highness” ที่แสดงถึงความสมฐานะในการเป็นเจ้าชายแห่งคริสตจักร (Prince of the Church)
หลังจากที่ก่อตั้งตัวขึ้นในมอลตาแล้ว อัศวินฮอสปิทัลเลอร์ก็ขาดจากเหตุผลเดิมในก่อตั้งเป็นคณะ ซึ่งเมื่อก่อตั้งขึ้นมีจุดประสงค์ในการเข้าร่วมในสงครามครูเสดในดินแดนศักดิ์สิทธิ์ เมื่อย้ายมาอยู่ที่มอลตาแล้วก็เป็นสิ่งที่เป็นไปไม่ได้เพราะตำแหน่งที่ตั้งและกำลังทรัพย์ เมื่อรายได้จากผู้อุปถัมภ์ในยุโรปผู้ไม่เต็มใจที่ส่งเงินจำนวนมามาดำเนินการสนับสนุนองค์การที่ขาดจุดประสงค์ลดน้อยลง อัศวินฮอสปิทัลเลอร์ก็หันไปหาการรักษาความปลอดภัยในทะเลเมดิเตอเรเนียนจากอันตรายจากโจรสลัดที่เพิ่มมากขึ้น โดยเฉพาะจากออตโตมันที่สนับสนุนโจรสลัดบาร์บารีให้ก่อความไม่สงบในบริเวณฝั่งทะเลของแอฟริกาเหนือ จากความมีชื่อเสียงที่ได้รับในปลายคริสต์ศตวรรษที่ 16 หลังจากการป้องกันจากการถูกล้อมได้ในปี ค.ศ. 1565 พร้อมกับชัยชนะครั้งใหญ่ต่อจักรวรรดิออตโตมันของฝ่ายคริสเตียนในยุทธการเลอพานโตในปี ค.ศ. 1571 อัศวินฮอสปิทัลเลอร์ก็ตั้งตนเป็นองค์อุปถัมภ์พ่อค้าชาวคริสต์ที่คนส่งสินค้าไปมากับลว้าน และทำการปลดปล่อยคริสต์ศาสนิกชนที่ถูกจับไปเป็นทาสโดยโจรสลัดบาร์บารี ซึ่งมาเรียกว่า "คอร์โซ"
แต่กระนั้นไม่นานอัศวินฮอสปิทัลเลอร์ก็ต้องพยายามดำเนินการรักษาคณะด้วยรายได้ที่ลดต่ำลง การเพิ่มหน้าที่ในการรักษาความปลอดภัยในทะเลเมดิเตอเรเนียนให้แก่สาธารณรัฐเวนิส, สาธารณรัฐเจนัว และ ฟลอเรนซ์ก็เท่ากับเป็นการสร้างความรับผิดชอบในฐานะผู้พิทักษ์เช่นที่เคยทำมาก่อน ปัญหาที่มีอยู่ทวีคูณขึ้นเมื่อในระหว่างช่วงเวลานี้อัตราแลกเปลี่ยนของเงินตราท้องถิ่นต่อ "สคูโด" ที่ก่อตั้งขึ้นในปลายคริสต์ศตวรรษที่ 16 กลายมาล้าสมัยไป ซึ่งหมายความว่าอัศวินค่อย ๆ ได้รับเงินสนับสนุนจากพ่อค้าน้อยลงเป็นลำดับ ปัญหาทางเศรษฐกิจประกอบกับที่ดินที่แห้งแล้งที่อาศัยอยู่ ก็ทำให้อัศวินมีพฤติกรรมเลยเถิดไปถึงการปล้นเรือมุสลิม การปล้นที่บ่อยครั้งขึ้นทำให้อัศวินมีเงินมาใช้อย่างฟุ่มเฟือย เอาผู้หญิงท้องถิ่นเป็นภรรยา และเข้าร่วมกับกองเรือฝรั่งเศสและสเปนในการเดินทางผจญภัยต่าง ๆ เพิ่มรายได้ให้มากยิ่งขึ้น พฤติกรรมต่าง ๆ เหล่านี้ตรงกันข้ามกับการถือคำปฏิภาณในการรักษาความสมถะเมื่อเข้าเป็นนักบวชตามหลักปฏิบัติของคณะ ความเปลี่ยนแปลงทางทัศนคติของอัศวิน ประจวบกับการปฏิรูปศาสนาฝ่ายโปรเตสแตนต์ และ การปฏิรูปคาทอลิก และการขาดเสถียรภาพของสถาบันโรมันคาทอลิก เหตุการณ์ต่าง ๆ เหล่านี้มีผลกระทบกระเทือนต่ออัศวินอย่างรุนแรง เมื่อในคริสต์ศตวรรษที่ 16 และ 17 เกิดความเสื่อมโทรมด้านทัศนคติทางศาสนาของผู้คนทั่วไปในยุโรป ที่ทำให้ความสำคัญของการมีคณะอัศวินลดถอยลง ซึ่งก็แปลว่าการสนับสนุนทางการเงินจากชาติต่าง ๆ ในยุโรปก็ลดน้อยลงตามไปด้วย การที่อัศวินโรมันคาทอลิกเริ่มพิจารณายอมรับอังกฤษเข้ามาเป็นรัฐสมาชิก หลังจากที่ สมเด็จพระเจ้าเฮนรีที่ 8 แห่งอังกฤษ แยกตัวออกไปเป็นคณะอิสระอยู่ชั่วระยะหนึ่ง เมื่อสมเด็จพระราชินีนาถเอลิซาเบธที่ 1 แห่งอังกฤษผู้เป็นพระราชินีโปรเตสแตนต์ขึ้นครองราชย์ก็เป็นการแสดงให้เห็นถึงการยอมรับลัทธิอื่นของอัศวิน อัศวินฮอสปิทัลเลอร์ถึงกับมีเขตเยอรมันซึ่งมีทั้งโปรเตสแตนต์และโรมันคาทอลิกเท่า ๆ กัน
ความเสื่อมโทรมทางจริยธรรมของอัศวินฮอสปิทัลเลอร์ในช่วงนี้แสดงให้เห็นอย่างเด่นชัดจากการตัดสินใจของอัศวินหลายคนในการเข้ารับราชการในราชนาวีต่างประเทศและกลายเป็น "ทหารรับจ้าง" (sea-dogs) แห่งคริสต์ศตวรรษที่ 14 ถึงคริสต์ศตวรรษที่ 17 โดยนิยมกันไปทำงานให้กับฝรั่งเศส การไปเป็นทหารรับจ้างเป็นข้อที่ตรงกันข้ามกับหลักการของอัศวินฮอสพิทาลเลอร์อย่างที่สุด ตรงที่การไปทำงานให้กับมหาอำนาจในยุโรปเป็นโอกาสที่อาจจะเป็นไปได้ที่จะนำไปสู่การที่อัศวินต้องไปต่อสู้กับกองทัพคริสเตียนของอีกฝ่ายหนึ่ง เช่นในการปะทะกันประปรายทางนาวีระหว่างฝรั่งเศสกับสเปนที่เกิดขึ้น สิ่งที่เป็นปฏิทรรศน์มากที่สุดก็เมื่อฝรั่งเศสไปเป็นพันธมิตรกับออตโตมันอยู่หลายปี ผู้ซึ่งเป็นศัตรูอันสำคัญของอัศวินและผู้เป็นเหตุผลหลักในการดำรงตัวของคณะเอง ฝรั่งเศสไปลงนามในสัญญาทางการค้าหลายฉบับ และ ถึงกับไปตกลงสงบศึก (ที่ไม่มีผล) กับออตโตมันในช่วงเวลานี้ด้วย การที่อัศวินเข้าไปพัวพันกับพันธมิตรของศัตรูหมายเลขหนึ่งแสดงให้เห็นถึงความลักลั่นทางจรรยาธรรมของอัศวินและความสำคัญทางการค้าที่เพิ่มมากขึ้นในทะเลเมดิเตอเรเนียนในขณะนั้น การไปทำงานให้กับราชนาวีต่างประเทศโดยเฉพาะฝรั่งเศสเป็นการเปิดโอกาสให้อัศวินได้ทำหน้าที่ทางศาสนาและรับใช้พระมหากษัตริย์, เพื่อเพิ่มการเป็นที่รู้จักของราชนาวีที่รับราชการหรือมอลตา, เพื่อมีรายได้เพิ่มขึ้น และเพื่อหากิจการต่าง ๆ ทำเพื่อขจัดความจำเจ พฤติกรรมนี้แสดงให้เห็นว่าอัศวินเริ่มจะละทิ้งความภักดีต่อทั้งคณะและศาสนา แต่ผู้ที่ได้ประโยชน์คือฝรั่งเศสที่ได้กองกำลังทางนาวีที่มีประสบการณ์ที่ช่วยเพิ่มความมั่นคงทางด้านภัยที่มาจากสเปน การเปลี่ยนทัศนคติของอัศวินในระหว่างช่วงนี้สรุปได้จากคำกล่าวของพอล ลาครัวซ์ที่ว่า:
"ฐานะที่เพิ่มขึ้นจากความมั่งคั่งร่ำรวย การมีอภิสิทธิ์ที่ทำให้เป็นเหมือนราชรัฐ ... คณะในที่สุดก็ขาดจริยธรรมจากความฟุ่มเฟือย และ การปราศจากกิจการ ที่ทำให้เลิกคิดถึงจุดประสงค์เดิมที่แท้จริในการก่อตั้งคณะ และหันไปอ้าแขนรับความสำราญ ความละโมบและความหยิ่งในที่สุดก็ไม่มีขอบเขต อัศวินแสร้งทำตนว่าเหนืออำนาจของผู้ใด โดยเที่ยวยึดเที่ยวปล้นโดยไม่คำนึงว่าเป็นทรัพย์สินของผู้ใดไม่ว่าจะเป็นของผู้นอกศาสนาหรือคริสเตียน".
เมื่ออัศวินฮอสปิทัลเลอร์มีชื่อเสียงและความมั่งคั่งร่ำรวยขึ้น รัฐในยุโรปก็เริ่มหมดความสนใจกับคณะและไม่เต็มใจที่จะให้เงินสนับสนุนอย่างที่เคยทำมาให้แก่คณะที่หารายได้ได้ดีจากการรุกรานทางทะเล ฉะนั้นวัฏจักรของความเสื่อมโทรมที่เกิดจากการมีรายได้เพิ่มขึ้นซึ่งเป็นการลดเงินสนับสนุนก็เกิดขึ้น จนกระทั่งในที่สุดอัศวินก็ต้องพึ่งรายได้จากการหากินทางทะเลแต่เพียงอย่างเดียว เหตุผลอีกประการหนึ่งที่มหาอำนาจในยุโรปหันความสนใจจากอัศวินฮอสปิทัลเลอร์และหันไปสนใจกับปัญหาบนผืนแผ่นดินใหญ่ก็เนื่องมาจากสงครามสามสิบปี ในเดือนกุมภาพันธ์ ค.ศ. 1641 ก็มีจดหมายจากบุคคลสำคัญผู้ไม่ทราบนามในวาลเล็ตตาในมอลตาไปถึงพระเจ้าหลุยส์ที่ 14 พันธมิตรสำคัญของอัศวินที่กล่าวถึงปัญหาที่ประสบ:
"อิตาลีให้ความสนับสนุนเราแต่ไม่มาก โบฮีเมียและเยอรมนีเกือบไม่ได้สนับสนุน และอังกฤษและเนเธอร์แลนด์เป็นเวลาเนิ่นนานแล้วที่ไม่ได้สนับสนุนแต่อย่างใด เรามีบางสิ่งที่สามารถทำให้ดำรงตัวอยู่ได้ เซอร์ ในราชอาณาจักรของท่านและในสเปน"
แต่ที่น่าสังเกตคือไม่มีการกล่าวถึงรายได้อันดีที่ได้มาจากการหากินทางทะเล เจ้าหน้าที่มอลตาเห็นประโยชน์จากการเป็นโจรสลัดว่าเป็นรายได้สำคัญและส่งเสริมให้เกิดการกระทำนั้นมากขึ้น แม้ว่าอัศวินจะถือปฏิภาณความยากจนแต่ก็ได้รับอนุญาตให้เก็บสินค้าและทรัพย์สินที่ปล้นได้เป็นของตนเองส่วนหนึ่ง และ ให้ใช้ทุนทรัพย์ในการสร้างเสริมเรือให้แข็งแรงขึ้น นอกจากการปล้นสดมทางเรือแล้วอัศวินก็ยังมีกิจการการค้าทาสที่รุ่งเรืองพอกับโจรสลัดบาร์บารี
ปัญหาขัดแย้งใหญ่ของระบบการหากินของอัศวินฮอสปิทัลเลอร์คือการเรียกร้องในการบังคับใช้มาตรการในการมีอำนาจที่จะหยุดและขึ้นเรือทุกลำที่สงสัยว่าจะบรรทุกสินค้าออตโตมัน และยึดสินค้าและนำมาขายใหม่ในวาลเล็ตตา ซึ่งรวมทั้งกะลาสีซึ่งเป็นสินค้าที่มีค่าที่สุด พฤติกรรมที่ว่านี้ทำให้หลายชาติอ้างว่าเป็นตกเป็นเหยื่อจากการกระทำของอัศวินที่ยึดเรือแม้ว่าเป็นที่ต้องสงสัยเพียงเล็กน้อยว่าจะมีส่วนเกี่ยวข้องกับสินค้าที่มาจากตุรกี เมื่อปัญหาเริ่มบานปลายขึ้นเจ้าหน้าที่มอลตาพยายามควบคุมโดยก่อตั้งศาล 'Consiglio del Mer' สำหรับกัปตันเรือผู้มีความรู้สึกว่าถูกปฏิบัติอย่างไม่เป็นธรรมสามารถร้องเรียนได้ และมักจะสำเร็จ การให้ใบอนุญาตทำกิจการหากินทางทะเลก็ได้รับการควบคุมมากขึ้นเพราะมอลตาพยายามรักษาสันติภาพกับมหาอำนาจในยุโรป แต่กระนั้นมาตรการก็ไม่ประสบผลสำเร็จไปเสียทั้งหมด ที่เห็นได้จากบันทึกจำนวนมากของคดีร้องเรียนต่าง ๆ จากศาล 'Consiglio del Mer' ตั้งแต่ ค.ศ. 1700 ในที่สุดพฤติกรรมดังกล่าวก็นำความหายนะมาให้แก่ลัทธิเอง
ในปี 1789 เกิดการปฏิวัติขึ้นในฝรั่งเศส มีการต่อต้านพวกขุนนางและชนชั้นสูงไปทั่วประเทศ ทำให้กลุ่มฮอสปิทัลเลอร์สูญเสียแหล่งเงินทุนในฝรั่งเศสไปอย่างถาวร เมื่อการปฏิวัติจบลง รัฐบาลใหม่ของฝรั่งเศสก็สั่งยึดอสังหาริมทรัพย์และทรัพย์สินของฮอสพิทาลเลอร์ในฝรั่งเศสจนหมด
เมื่อปี 1798 ฐานที่มั่นของกลุ่มในมอลตาถูกนโปเลียนยึดในระหว่างการขยายอิทธิพลไปอียิปต์ของนโปเลียน ทางกลุ่มพยายามเจรจาต่อรองกับยุโรปเพื่อกลับคืนสู่อำนาจอีกครั้ง พระเจ้าซาร์แห่งรัสเซียจึงมอบที่หลบภัยให้พวกอัศวินในเมือง เซนต์ปีเตอร์สเบิร์ก
ด้วยการสนับสนุนจากพระสันตะปาปา ลีโอที่ 13 ทางกลุ่มก็ฟื้นคืนชีพขึ้นมาอีกครั้งในปี 1834 และมีศูนย์บัญชาการในกรุงโรม และเป็นที่รู้จักในชื่อ คณะทหารองค์อธิปัตย์แห่งมอลตา (Sovereign Military Order of Malta)
คณะทหารองค์อธิปัตย์แห่งมอลตาเป็นคณะโรมันคาทอลิก ได้รับการยอมรับจากสมาชิกถาวรแห่งสหประชาชาติ โดยมีกิจกรรมหลัก ๆ ในเรื่องทางศาสนา การกุศล และโรงพยาบาล และเป็นที่รู้จักกันในชื่อคณะแห่งมอลตา (Order of Malta) คติประจำกลุ่มคือ Tuitio Fidei et Obsequium Pauperum เป็นภาษาละติน แปลว่า "ผู้ปกป้องความศรัทธาและช่วยเหลือผู้ยากไร้" (Defence of the faith and assistance to the poor)
ในปัจจุบัน ยังมีกลุ่มเลียนแบบอัศวินฮอสปิทัลเลอร์เป็นจำนวนมาก ซึ่งไม่มีความเกี่ยวข้องอันใดกับกลุ่มของจริง